从植物组织中提取RNA 是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析,纯化mRNA 以用于体外翻译或建立cDNA文库,RT-PCR及差示分析等分子生物学研究,都需要高质量的RNA 。因此,从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA 是顺利进行上述研究的关键所在。

从文献报道上看,有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA ,而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。一般认为在这些植物组织中,或富含酚类化合物,或富含多糖,或含有某些尚无法确定的次级代谢产物,或RNase的活性较高。在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的,但当组织被研磨,细胞破碎后,这些物质就会与RNA 相互作用。酚类化合物被氧化后会与RNA 不可逆地结合,导致RNA 活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA 的丢失,或形成不溶性复合物;而多糖会形成难溶的胶状物,与RNA 共沉淀下来;萜类化合物和RNase会分别造成RNA 的化学降解和酶解。对于这些植物材料,用常规的RNA 提取方法(如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等)难以提取出其RNA 。如Lбpez-Gбmez等在用常规的方法提取芒果果实的RNA 时未能成功,他们的结果分为三种情况:提出的RNA 已被降解;RNA 的得率很低;得到的RNA 不能进行体外翻译。他们认为在果实成熟时各种酶的活性增强,其中也包含RNase,不溶性的淀粉转化为可溶性的多糖,芒果果实细胞壁中特殊的成份,以及果实中高含量的多酚化合物都是干扰RNA 提取的因素。Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果实的RNA 时,发现RNA 与某种未知化合物凝聚成不溶性的复合物,并且这种未知化合物在230nm和270nm处有强的光吸收,从而干扰了RNA 紫外吸收的测定。因此能否有效地去除多糖、酚类化合物、RNase和干扰RNA 提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA 成败的关键。本文根据文献综述了解决上述植物RNA 提取过程中难点的相应对策。

1 防止酚类化合物的干扰

许多植物组织特别是植物的果实(如苹果、樱桃、李子、葡萄等)和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA 。此外,针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时,酚类物质会释放出来,氧化后使匀浆液变为褐色,并随氧化程度的增加而加深,这一现象被称为褐化效应(browningeffect)。被氧化的酚类化合物(如醌类)能与RNA 稳定地结合,从而影响RNA 的分离纯化。但Newbury等发现RNA 提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性,因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA 的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质(如原花色素类物质)是影响RNA 提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化,然后再将其与RNA 分开。

1.1 防止酚类化合物被氧化

还原剂法:一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化,有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达 2%。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA 时加入(-巯基乙醇(终浓度1%)可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠(NaBH4)是一种可还原醌的还原剂,用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减,醌类化合物可被还原成多酚化合物。

螯合剂法:螯合剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)中的CO-N=基有很强的结合多酚化合物的能力,其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基,因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物,使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化,并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素,在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低。当原花色素类物质量较大时,单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物,因而需要与其它方法结合使用。

Tris-硼酸法:如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸(pH7.5),其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物,从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA 的结合。这一方法十分有效,所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高(>0.2M)则会影响RNA 的回收率。

牛血清白蛋白(BSA)法:原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原-抗体间的相互作用,形成可溶性的或不溶性的复合物,减小了原花色素类物质与 RNA 结合的机会,因此提高了RNA 的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase,因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。

丙酮法:Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料,可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA 。

Guillemant等和Ainsworth认为低pH值(pH5.5)的提取缓冲液可以防止酚类化合物的离子化和进一步的氧化。

1.2酚类化合物的去除

通过Li+或Ca2+沉淀RNA 的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚,可以直接通过离心去除掉,或在苯酚、氯仿抽提时除去。 Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇(50%)来沉淀RNA ,而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50%2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA 沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化,其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除,无需再用NaBH4来处理。

2 防止多糖的干扰

多糖的污染是提取植物RNA 时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖,而多糖的许多理化性质与RNA 很相似,因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA 也被裹携走了,造成RNA 产量的减少;而在沉淀RNA 时,也产生多糖的凝胶状沉淀,这种含有多糖的RNA 沉淀难溶于水,或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性[15],因此污染了多糖的RNA 样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中,通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖;在高浓度Na+或K+离子存在条件下,通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖;通过LiCl沉淀RNA 也可以将部分多糖留在上清液中[7]。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA 混杂在一起,所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA 分离纯化时多糖污染的问题。

用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA 提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10%~30%,可以使多糖沉淀下来,而RNA 仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇,如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA 时,在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10%以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA 时,是在用CsCl超离心,乙醇沉淀之后的RNA 溶液中加入终浓度30%乙醇来沉淀多糖的,进一步纯化了RNA 样品。

另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA 时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾(pH4.8)溶液以沉淀多糖;Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA 时加入的是1/5体积的5M醋酸钾(pH4.8)溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA 时是加1/3体积的8.5M醋酸钾(pH6.5)溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA 时,是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA 时,是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时,单独使用乙醇或醋酸钾都无效,只有两者结合使用效果最佳。

Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA 时,缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M,通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA 将RNA 与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释,调节Na+离子浓度至80mM,然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。

3 减少蛋白杂质的影响

蛋白质是污染RNA 样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质,因而要获得完整的、高质量的RNA 就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性;提取缓冲液中含有蛋白质变性剂,如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等,这样在匀浆时可以使蛋白质变性,凝聚;有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。

Wilcockson利用蛋白质与RNA 在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70%高氯酸钠溶液中,RNA 的溶解度大于蛋白质的溶解度,因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇,这时RNA 能沉淀下来而能溶于70%高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。

4 防止次级代谢产物的影响

从植物组织中提取高质量RNA 的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物,这些次级代谢产物很容易与RNA 结合并与RNA 共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA 的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质,所以,目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、 Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA 回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA 。

由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性,使得植物组织RNA 的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现,即使同一种植物的不同组织其RNA 提取方法会有很大的不同;含有某种干扰因素的不同植物材料,其适用的RNA 提取方法可能不同;即使是同一种植物同一种组织材料,但来源于不同基因型植株,其RNA 提取方法也可能不一样。所以,对于某一植物或其组织来说,其相应的RNA 提取方法必需经过摸索和实践才能确立。

随着植物分子生物学研究领域的拓宽,可以肯定地说,在作为其研究基础的植物材料RNA 提取过程中还会出现新的难点,但随着不断地探索和经验的积累,科学工作者们一定会迅速地解决这些难点,为植物分子生物学的发展铺平道路。